梁山伯自幼与寡母相依为命，读书勤奋，且生性乐善助人，赴杭城尼山书院求学。而祝公达则独霸一方，其女祝英台不仅聪颖敏慧，好学不倦。山伯与乔装的英台在城内遇上，惺惺相惜义结金兰，来到书院后，曾救他们的侠士路秉章亦前来求学，三人结为知己。英台屡次险被山伯发现其为女儿身，巧施妙计脱离。为掩人耳目，英台只好接受书院夫子程雍之女儿丁香的爱意。未料，山伯再次撞破英台扮回女装之身，山伯又被妙计所骗，但对英台的美貌留下深刻印象。

程雍向英台提亲被拒，丁香落落寡欢，执意寻死，英台有告知直相，丁香一时无法接受，但在情绪平复后，二人化为姊妹之情。祝威酒醉后无意向宜兴府太守马俊升之子马文才道出其妹英台秀丽脱俗，女扮男装到书院读书之事，使文才对英台起了好奇之心。

文才转来尼山书院读书，乍见英台虽女扮男装，却是俊秀脱俗，屡藉机亲近，一次，更于英台沐浴时，趁机潜入，迫英台就范，英台却言文才若要强占己身，但此心仍属山伯，文才暂且放过英台。文才表面装作友善，为英台保守秘密，内里妒火中烧，多次伺机陷害山伯。山伯中计险送命，与英台反而因患难而加深情谊。秋围试举揭榜，山伯高中魁首。英台、山伯均得回乡，英台暗示要山伯尽快来祝家提亲，迎娶九妹，山伯似懂非懂，直至师母言明英台身份，山伯才恍然大悟，待发派官职后，立往祝府提亲。

山伯偕母喜孜孜地来祝府提亲，未料却惊见公远夫妻竟是杀害山伯生父的仇人，梁母拉了山伯立刻离开祝家，梁母深怕二十多年的冤怨再起，遗害山伯前程，不愿说明。公远力阻英台与山伯见面，积极推动与马家亲事，并深锁英台于闺房内。

梁母见山伯非英台不娶，遂道出其身世，出伯原是姓赵，其父赵庆平为马俊升、祝公远联手杀害，山伯惊闻，决心重审二十多年前的杀父血案。英台获悉山伯义断情绝之意伤恸不已，悬梁自尽，幸及时获救。山伯夹在爱与恨之间，亦感矛盾痛苦。山伯知杀父之仇全是马家一手策划，欲法办马俊升，未料文才棋高一着，先一步扣山伯以贪污罪嫌。英台求救山伯，被迫答应文才。为除后患，文才暗中用杀手取山伯性命，梁母为保山伯而身受重伤，山伯亦奋不顾身保护母亲，其孝心感动杀手，因而放梁家一条生路。山伯巧遇英台，英台执意将梁母带回祝家疗伤。不料，被公远发现，文才欲亲自解决二人，幸梁家得以逃离。

英台在成亲前夕，竟与梁家一同患难，深感一切皆为天意。山伯与英台得到梁母与祝母的认同，躲在荒废的尼山书院。山伯与英台在书院内举行简单的婚礼，后得知丁香被赵中书所害而沦落风尘，决定设法赎出丁香。英台乔装回祝家拿钱，与祝母不胜感慨。英台回祝家之事被文才知道，并跟踪至尼山书院，幸山伯英台顺利逃脱，但文才继续穷追不舍。

文才带兵追捕，危急关头，已成为征西大将军的路秉章出现解救了他们，并将文才定罪，押解进京。赵中书假传圣旨，救下文才。文才立即带人赶往尼山书院，把山伯打成重伤，弃置荒野，后被丁香救回梁家。文才掳回英台将其玷污，发现英台非完璧之身，盛怒之下将其痛打，并丢在祝家门口。英台遭此巨变，神智错乱，六亲不认，只对山伯有好感。一日，山伯为英台试穿梁母所做的新衣，触动了英台的记忆，神智恢复。两家一笑泯恩仇，山伯择日前来迎娶。

祝威出差回到江南，认为文才能助他青云直上，要英台嫁入马家，遂向文才告密英台神智恢复。祝父母被文才抓走，而山伯英台等则逃离，丁香自愿前去与文才交涉，谎称山伯与梁母丢下英台径自逃命，英台心死，愿意嫁与文才为妻，救回祝父母。岂料文才发现新娘乃是丁香假扮，拦下了正欲逃走的山伯、英台等人。文才抓住英台，将山伯毒打至死。英台与山伯是否从此阴阳相隔，难难两人最终只能含冤化蝶。